Глава 22. Иммунологические методы диагностики инфекционных заболеваний
Х. Кесарвала, Дж. Кишияма
I. Иммунный ответ при инфекционных заболеваниях. Иммунный ответ — это реакция на чужеродный антиген, которая приводит к накоплению и активации клеток, участвующих в его удалении. Течение и исход любой инфекции зависят от силы иммунного ответа на антигены возбудителя.
А. Механические барьеры — кожа, слизистые, мерцательный эпителий дыхательных путей и ЖКТ — препятствуют попаданию микробов в кровь.
Б. Макрофаги препятствуют диссеминации инфекции. В защите от инфекции участвуют как макрофаги, например купферовские клетки, альвеолярные и перитонеальные макрофаги, так и циркулирующие моноциты. Макрофаги захватывают и уничтожают микробы, расщепляют антигены и представляют его T-хелперам.
В. Антитела, как и макрофаги, предотвращают диссеминацию инфекции.
1. IgM составляют основную часть антител, вырабатываемых при первичном иммунном ответе. IgM обладают высокой способностью к связыванию и активации комплемента, агглютинации и опсонизации микробов.
2. IgA присутствуют в сыворотке, лимфе, слезе, грудном молоке, на слизистых и в их секретах, например в слюне. Эти антитела участвуют в защите от микробов, попадающих на слизистые.
3. IgG составляют около 80% иммуноглобулинов сыворотки и являются основными антителами, которые обеспечивают защиту от бактерий, грибов и вирусов.
Г. Лимфоциты. Существуют три популяции лимфоцитов: B-, T- и NK-лимфоциты. B-лимфоциты попадают в кровь и периферические органы иммунной системы из костного мозга и дифференцируются в плазматические клетки, продуцирующие антитела. T-лимфоциты также происходят из костного мозга, но созревают в тимусе. T-лимфоциты делятся на несколько субпопуляций, которые различаются по функциям и поверхностным антигенам (см. гл. 1, п. II.А). В разрушении зараженных клеток участвуют по крайней мере 2 типа лимфоцитов. Это цитотоксические T-лимфоциты — лимфоциты CD8, функция которых ограничена HLA, и NK-лимфоциты, функция которых не ограничена HLA и которые способны разрушать инфицированные клетки на ранних стадиях инфекционного процесса, до появления цитотоксических T-лимфоцитов. Существуют 2 механизма, с помощью которых лимфоциты уничтожают микроорганизмы: разрушение инфицированных клеток при непосредственном контакте и выработка цитокинов, активирующих макрофаги. Больные с недостаточностью клеточного иммунитета подвержены таким заболеваниям, как туберкулез, корь, диссеминированный кандидоз, инфекция, вызванная вирусом varicella-zoster, даже при нормальном гуморальном иммунитете.
Д. Комплемент — это система сывороточных белков, которые разрушают клетки и участвуют в воспалении и регуляции иммунного ответа. Благодаря способности опсонизировать микроорганизмы, связываясь с их поверхностью непосредственно или через антитела, комплемент усиливает фагоцитарную активность макрофагов и нейтрофилов.
Е. Интерфероны — группа цитокинов, которые играют важную роль в иммунитете, в том числе противовирусном. Известны 3 типа интерферонов: интерферон альфа (вырабатывается лейкоцитами), интерферон бета (вырабатывается фибробластами) и интерферон гамма (вырабатывается активированными T-лимфоцитами).
II. Общие принципы иммунодиагностики инфекционных заболеваний
А. Анамнез. При оценке результатов серологических исследований учитывают следующие данные.
1. Анамнез заболевания.
2. Сведения о перенесенных заболеваниях.
3. Сведения о вакцинации (сроки проведения и виды вакцин).
4. Сведения о поездках.
5. Место жительства и контакт с неблагоприятными факторами окружающей среды.
6. Сведения о контактах с источниками инфекции.
7. Сведения о контактах с животными.
8. Время года.
Б. Пробы для исследования. Для посева и определения антигенов возбудителя можно использовать разные ткани и биологические жидкости. Для определения антител к возбудителю обычно используют сыворотку, СМЖ и синовиальную жидкость. Чтобы выявить нарастание титра антител к какому-либо возбудителю, пробы сыворотки забирают в период разгара и в период выздоровления. При обнаружении антител в СМЖ исключают поражение ЦНС.
III. Иммунологические методы, применяемые для диагностики инфекционных заболеваний, приведены в табл. 22.1.
А. РИА — высокочувствительный метод, основанный на реакции антиген—антитело, один из компонентов которой несет радиоактивную метку. Метод позволяет обнаруживать как антигены, так и антитела и определять их концентрацию в исследуемой пробе.
Б. Иммунофлюоресцентный анализ также применяют для выявления как антигенов, так и антител. Этот метод основан на использовании реагентов, меченных флюоресцентным красителем. Антитела чаще всего метят флюоресцеина изотиоцианатом. Меченые антитела связываются с антигеном, образуя комплексы, которые можно выявить с помощью флюоресцентной микроскопии. Существуют три модификации иммунофлюоресцентного анализа.
1. Метод прямой иммунофлюоресценции применяют для выявления антигенов. Он основан на непосредственном связывании антигена, сорбированного на твердой подложке, с мечеными антителами. Реакцию оценивают с помощью флюоресцентного микроскопа.
2. Метод непрямой иммунофлюоресценции позволяет выявить антитела к известному антигену. Антиген, сорбированный на твердой подложке, связывается с немечеными антителами. Комплексы антиген—антитело выявляются с помощью меченых антител к иммуноглобулинам.
3. Метод конкурентной иммунофлюоресценции основан на связывании стандартного меченого и присутствующего в исследуемой пробе немеченого антигенов с антителами, сорбированными на твердой подложке. Поскольку меченый и немеченый антигены конкурируют за связывание с антителами, по количеству связанного меченого антигена можно определить концентрацию антигена в исследуемой пробе.
В. Методы, основанные на реакции преципитации. При взаимодействии растворимых антигенов с антителами образуются высокомолекулярные комплексы антиген—антитело, которые выпадают в виде осадка в растворе или откладываются в виде полос преципитации в геле. Использование очищенных антигенов позволяет определить концентрацию антител в исследуемой пробе.
1. Преципитация в растворе. При добавлении антигена в возрастающей концентрации к одному и тому же количеству антител выпадает разное количество преципитата. Можно построить график — кривую преципитации, — который отражает зависимость между концентрацией антигена и количеством преципитата: при избытке антител количество преципитата возрастает с увеличением концентрации антигена, в зоне эквивалентности (количество антигена примерно равно количеству мест связывания на антителах) образуется максимальное количество преципитата, при избытке антигена количество преципитата уменьшается с увеличением концентрации антигена.
2. Иммунодиффузия — наиболее распространенный из всех методов, основанных на реакции преципитации (см. гл. 20, пп. I.Б—В).
а. Простая радиальная иммунодиффузия. Суть метода заключается в следующем: 1) в тонком слое геля, содержащего антитела в известной концентрации, вырезают лунки; 2) антиген, помещенный в эти лунки, диффундирует в гель; 3) вокруг лунок образуются кольца преципитации, диаметр которых пропорционален концентрации антигена. Метод обычно применяется для определения концентрации иммуноглобулинов.
б. Двойная радиальная иммунодиффузия. Суть метода заключается в следующем: 1) в тонком слое геля вырезают лунки для антигена и антител; 2) антиген и антитела диффундируют навстречу друг другу, образуя линии преципитации на некотором расстоянии от лунок. По расстоянию от лунки с антигеном до линии преципитации можно определить концентрацию антигена.
3. Электрофорез
а. Иммуноэлектрофорез представляет собой сочетание двух методов — иммунодиффузии и зонального электрофореза. Иммуноэлектрофорез применяется в основном для исследования сывороточных белков. Суть метода заключается в следующем: 1) в лунку, вырезанную в тонком слое геля, помещают исследуемую сыворотку; 2) проводят электрофоретическое разделение белков сыворотки; 3) в геле вырезают бороздку, параллельную направлению миграции белков при электрофорезе, и заполняют ее смесью антител к сывороточным белкам; 4) разделенные при электрофорезе белки (антигены) и антитела диффундируют навстречу друг другу. В местах связывания антител с антигенами образуются дуги преципитации (см. гл. 20, п. I.А).
б. Встречный электрофорез. Суть метода заключается в следующем: 1) исследуемые антигены и смесь антител помещают в лунки, расположенные на противоположных концах пластины с гелем; 2) вдоль линии, соединяющей лунки, пропускают постоянный электрический ток; 3) в электрическом поле антитела и антигены быстро перемещаются по направлению друг к другу; 4) в месте связывания антигенов с антителами образуются линии преципитации. Встречный электрофорез применяют в тех случаях, когда антигены и антитела обладают разной электрофоретической подвижностью. Этот метод позволяет быстро определить антигены или антитела в исследуемой пробе и применяется в экспресс-диагностике инфекционных заболеваний.
Г. Методы, основанные на реакции агглютинации, довольно чувствительны и применяются для выявления антигенов на поверхности клеток или частиц и полуколичественного определения антител к этим антигенам. Суть методов заключается в следующем: при связывании клеток или частиц, покрытых антигеном, с антителами образуются крупные агрегаты. Для определения титра антител к поверхностным антигенам клеток или к антигенам, сорбированным на поверхности частиц, смешивают известное количество клеток или частиц, покрытых антигеном, с разными разведениями исследуемой пробы, например сыворотки.
1. Реакция прямой агглютинации применяется для выявления поверхностных антигенов микробов или клеток крови и антител к этим антигенам. Суть метода заключается в следующем: серийные разведения исследуемой пробы (например, сыворотки) смешивают с клетками, за титр антител принимают величину, обратную максимальному разведению сыворотки, которое вызывает агглютинацию. Этот метод более чувствителен, чем методы, основанные на преципитации, поскольку при равной концентрации антигена объем агглютината больше объема преципитата. Реакция агглютинации не зависит от температуры, если только не обусловлена холодовыми агглютининами, которые более эффективны при температуре ниже 37°C.
2. Реакция непрямой агглютинации основана на агглютинации эритроцитов, других клеток или частиц (например, латекса или бентонита), покрытых антигеном. Для определения титра антител серийные разведения сыворотки в физиологическом растворе смешивают с известным количеством покрытых антигеном клеток или частиц. Реакция непрямой агглютинации — чувствительный метод, позволяющий определять растворимые антигены в низких концентрациях.
Д. Реакция связывания комплемента. Суть метода заключается в следующем: 1) антиген смешивают с антителами; 2) к образовавшимся комплексам антиген—антитело добавляют известное количество комплемента, который связывается с этими комплексами; 3) количество несвязанного комплемента оценивают в реакции гемолиза с эритроцитами барана.
Е. Твердофазный ИФА — надежный, экономичный и высокочувствительный метод. Он основан на использовании стандартных препаратов очищенных антигенов или антител, ковалентно связанных с ферментом. Эти препараты сохраняют и иммунологические свойства, и ферментативную активность, которую можно измерить при добавлении субстрата данного фермента (см. гл. 20, п. I.Е).
Ж. Другие методы
1. Определение уровня C-реактивного белка. C-реактивный белок — белок острой фазы воспаления, относящийся к бета-глобулинам. C-реактивный белок, как и другие белки острой фазы воспаления, появляется в сыворотке вскоре после повреждения тканей и начала воспаления. Повышение уровня C-реактивного белка наблюдается при острых бактериальных и вирусных инфекциях, инфаркте миокарда, злокачественных новообразованиях и аутоиммунных заболеваниях (см. гл. 15, п. II.Б).
2. Определение титра холодовых агглютининов. Холодовые агглютинины — это IgM, которые вызывают максимальную агглютинацию эритроцитов при 4°C. Холодовые агглютинины появляются при некоторых заболеваниях, например при микоплазменной пневмонии, реже при гриппе, аденовирусной инфекции и других острых респираторных заболеваниях, а также при сонной болезни. Диагностически значимым считается выявление холодовых агглютининов в титре 1:32 или четырехкратное повышение их титра в течение 7—14 сут.
3. Определение титра агглютинирующих антител. Агглютинирующие антитела к возбудителю появляются в сыворотке при многих инфекционных заболеваниях: сальмонеллезе, паратифе, бруцеллезе, туляремии, риккетсиозе и других. Титр этих антител можно определить в реакции агглютинации инактивированных бактерий при добавлении разных разведений сыворотки. Сыворотку для исследования обычно собирают дважды: в период разгара и в период выздоровления (через 10—21 сут). Диагностически значимым считают четырехкратное повышение титра антител.
4. Реакция Нейфельда — набухание клеточной стенки бактерий под действием антител к типоспецифическим капсульным полисахаридам, видимое при световой микроскопии. Эту реакцию можно наблюдать при добавлении антител, направленных против полисахаридов клеточной стенки Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae и Neisseria meningitidis (серотипов A и C), к этим бактериям. Реакция Нейфельда применяется для исследования сыворотки и СМЖ.
5. Реакция с лизатом амебоцитов мечехвоста (Limulus polyphemus) применяется для диагностики инфекций, прежде всего сепсиса и менингита, вызванных грамотрицательными бактериями. Метод основан на том, что при добавлении бактериальных эндотоксинов жидкий лизат амебоцитов меченосца превращается в гель.
IV. Кожные пробы, основанные на аллергических реакциях замедленного типа, — наиболее простой и доступный способ оценки клеточного иммунитета.
А. Антигены для проведения кожных проб. Кожные пробы обычно проводят с очищенным туберкулином, трихофитоном, дерматофитином 0, столбнячным анатоксином, антигенами вируса эпидемического паротита и Coccidioides immitis (см. гл. 18, п. III.Ж и табл. 22.2).
Б. Заболевания и состояния, которые сопровождаются угнетением клеточного иммунитета и, следовательно, аллергических реакций замедленного типа, перечислены ниже.
1. Первичные и вторичные иммунодефициты.
2. Острые вирусные инфекции, в том числе эпидемический паротит, краснуха, корь, инфекция, вызванная вирусом varicella-zoster, грипп, инфекционный мононуклеоз.
3. Грибковые инфекции, например кокцидиоидоз, криптококкоз, аспергиллез.
4. Бактериальные инфекции, в том числе туберкулез, бактериальные менингит и пневмония.
5. Злокачественные новообразования.
6. Иммунизация живыми вирусными вакцинами.
7. Лечение кортикостероидами и иммунодепрессантами.
8. Аутоиммунные заболевания.
9. Большие операции.
10. Истощение.
В. Техника проведения кожных проб
1. Участок кожи для инъекции обрабатывают антисептиком.
2. Внутрикожно вводят 0,1 мл раствора антигена. Для этого используют туберкулиновый шприц объемом 1 мл и иглу 27 G длиной 12 мм.
3. Место инъекции обводят несмываемым карандашом.
4. Через 24—72 ч (в зависимости от используемого антигена) измеряют два размера эритемы и папулы, рассчитывают средний и записывают результат кожной пробы в миллиметрах.
Г. Реакция на внутрикожное введение антигена и сроки ее развития зависят от вида антигена (см. табл. 22.2).
V. Диагностика вирусных инфекций. В настоящее время широко применяются 4 способа диагностики вирусных инфекций: 1) выделение вируса в культуре клеток (наиболее точный способ); 2) выявление цитоплазматических, внутриядерных включений и гигантских многоядерных клеток в окрашенных мазках; 3) выявление не менее чем четырехкратного возрастания титра антител к вирусу на разных стадиях заболевания; 4) выявление вируса или его антигенов в тканях и биологических жидкостях с помощью экспресс-тестов.
А. Материалом для выделения вируса в культуре клеток могут служить мазки со слизистой глотки и носоглотки, мокрота, моча, кал, кровь, СМЖ, экссудат, биоптат. При взятии проб соблюдают правила асептики, пробу помещают в стерильный контейнер и транспортируют в лабораторию. При подозрении на особо опасные инфекции соблюдают дополнительные меры предосторожности и используют специальное оборудование. Выделение возбудителя в этом случае проводят в специализированных лабораториях.
Б. Соскоб со дна везикулы
1. Делают надрез скальпелем по периферии везикулы.
2. Приподнимают отслоившийся эпидермис и удаляют жидкость с помощью тампона.
3. Скальпелем делают соскоб со дна везикулы. При этом следует избегать кровотечения.
4. Полученный материал переносят на 2 чистых предметных стекла и делают 2 мазка диаметром 5—10 мм.
5. Мазки высушивают на воздухе и фиксируют спиртом.
6. Фиксированные мазки окрашивают по Гимзе или обрабатывают антителами, меченными флюоресцентным красителем.
7. Для получения надежных результатов соскоб производят трижды.
В. Продукцию антител к вирусным антигенам можно оценить с помощью реакции нейтрализации, реакции торможения гемагглютинации, реакции связывания комплемента и твердофазного ИФА. Пробы крови (2—10 мл) забирают на ранней стадии заболевания и спустя 2—3 нед. В стерильных условиях получают сыворотку, помещают ее в стерильную пробирку и до отправки в лабораторию хранят в холодильнике или замораживают (–20°C). Диагностически значимым считается четырехкратное повышение титра антител в ходе заболевания.
1. Реакция связывания комплемента (см. гл. 22, п. III.Д).
2. Реакция нейтрализации — высокоспецифичный метод, основанный на связывании вируса антителами и его нейтрализации. Метод позволяет определить уровень противовирусных антител и способность исследуемой сыворотки нейтрализовать вирусы. Суть метода заключается в следующем: 1) производят серийные разведения исследуемой сыворотки; 2) разные разведения сыворотки смешивают с известным количеством вируса; 3) сыворотку добавляют к культуре клеток, восприимчивой к данному вирусу; 4) нейтрализующую активность сыворотки оценивают по снижению способности вирусов инфицировать культуру клеток.
3. Реакция торможения гемагглютинации — высокоспецифичный и чувствительный метод, позволяющий определить даже незначительное количество противовирусных антител в биологических жидкостях. Этот метод основан на способности некоторых вирусов сорбироваться на эритроцитах, в частности на человеческих эритроцитах группы 0 и куриных эритроцитах, и вызывать гемагглютинацию. Если исследуемая биологическая жидкость содержит противовирусные антитела, при ее добавлении к вирусам будет наблюдаться торможение гемагглютинации. Чем выше содержание противовирусных антител в исследуемой жидкости, тем сильнее подавляется гемагглютинация.
Г. Для экспресс-диагностики вирусных инфекций применяют серологические методы, основанные на применении стандартных противовирусных антител. Эти методы перечислены ниже.
1. РИА.
2. Иммунофлюоресцентный анализ.
3. Твердофазный ИФА.
Д. Инфекционный мононуклеоз вызывает вирус Эпштейна—Барр. Заболевание обычно возникает в детском и молодом возрасте. К характерным проявлениям инфекционного мононуклеоза относятся лихорадка, боль в горле, увеличение лимфоузлов, спленомегалия, лимфоцитоз. Поскольку сходная клиническая картина наблюдается также при цитомегаловирусной инфекции, бруцеллезе, туляремии, остром токсоплазмозе и на ранних стадиях краснухи, для диагностики инфекционного мононуклеоза используют серологические методы.
1. Гетерофильные антитела — IgM, взаимодействующие с антигенами животных неродственных видов, например барана или быка. Эти антитела выявляются примерно у 90% больных инфекционным мононуклеозом. Гетерофильные антитела в низком титре могут присутствовать и у здоровых людей.
а. Проба Пауля—Буннелля — стандартный метод лабораторной диагностики инфекционного мононуклеоза. Он заключается в выявлении гетерофильных антител к эритроцитам барана с помощью реакции гемагглютинации. Гетерофильные антитела при инфекционном мононуклеозе отличаются от гетерофильных антител, присутствующих в сыворотке здоровых и больных сывороточной болезнью, по способности абсорбироваться тканью почек морской свинки и эритроцитами быка (см. табл. 22.3). Диагностически значимым считается титр 1:128—1:256. Гетерофильные антитела обычно обнаруживают через 3—4 нед после начала заболевания. Реакция Пауля—Буннелля бывает положительной при лейкозах, вирусных гепатитах, цитомегаловирусной инфекции, лимфоме Беркитта, ревматоидном артрите и после введения иммунных сывороток. Титр антител не отражает тяжести заболевания, однако при измерении в динамике позволяет следить за течением заболевания.
б. Экспресс-тест на гетерофильные антитела (Моно-Тест, Уэмпоул Лэборэтрис). Гетерофильные антитела в этом исследовании выявляются при агглютинации стабилизированных формалином эритроцитов лошади. Абсорбцию тканью почек морской свинки и эритроцитами быка не проводят.
2. Специальные серологические методы. Инфекционный мононуклеоз не всегда сопровождается появлением гетерофильных антител. Они, в частности, отсутствуют у детей. В этом случае применяют следующие серологические методы.
а. Антитела к капсидному антигену вируса Эпштейна—Барр выявляют методом иммунофлюоресценции. На ранней стадии заболевания в сыворотке больного появляются IgM к капсидному антигену. Их титр становится максимальным через 2 нед после начала заболевания и снижается в течение 2—3 мес. Присутствие IgM к капсидному антигену вируса Эпштейна—Барр свидетельствует о недавнем заражении, а IgG — о ранее перенесенном заболевании.
б. Антитела к ранним антигенам вируса Эпштейна—Барр выявляются методом непрямой иммунофлюоресценции. Титр этих антител становится максимальным через 2—3 нед после начала заболевания.
в. Антитела к ядерному антигену вируса Эпштейна—Барр выявляются методом непрямой иммунофлюоресценции с применением комплемента и меченых антител к нему. Антитела к ядерному антигену появляются примерно через 4 нед после начала заболевания и сохраняются на протяжении всей жизни.
